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03/07

Finalmente test affidabili, semplici da utilizzare ed economici

Un nuovo metodo di analisi della tossicità sulle cellule in coltura

Fonte: Comité Scientifique ‘Pro anima’

La morte cellulare causata da sostanze tossiche può avvenire per necrosi o apoptosi.

Nella necrosi la cellula e gli organismi intracellulari si gonfiano, la cellula si disintegra a seguito della rottura della membrana e i detriti provocano un’infiammazione dei tessuti che amplifica i danni cellulari.

L’apoptosi, o morte cellulare programmata, è invece un fenomeno naturale nello sviluppo degli esseri viventi. Pensiamo, ad esempio, alla scomparsa, all’interno dell’embrione umano, della membrana interdigitale, senza la quale le dita dell’uomo avrebbero forma palmata.

Nell’apoptosi le cellule morte sono eliminate senza che si verifichino infezioni.

La necrosi è dunque un fenomeno passivo mentre l’apoptosi è un fenomeno attivo e necessita della sintesi di proteine che servono a preparare la cellula per la morte programmata. I mitocondri, organuli cellulari anche noti come centrali energetiche della cellula perché coinvolti nella produzione di ATP, fonte di energia per la cellula, svolgono un ruolo molto importante nell’apoptosi.

I danni del DNA costituiscono una causa fondamentale di apoptosi, come pure le radiazioni ionizzanti e alcuni farmaci anti-tumorali. Questi agenti esercitano da una parte un effetto benefico in quanto provocano la morte delle cellule tumorali e dall’altra un indesiderato effetto citotossico ai danni delle cellule che si dividono rapidamente come le cellule ematopoietiche (che producono le cellule del sangue) o le cellule spermatogeniche (che producono gli spermatozooi).

Anche altre sostanze genotossiche, ovvero sostanze tossiche che si legano al DNA, o lo stress ossidativo provocano apoptosi. Essa si verifica in particolare quando i meccanismi di riparazione del DNA sono affaticati o inefficaci. Alcune sostanze tossiche, infine, provocano l’ apoptosi se assunte in basse dosi o all’inizio di un’intossicazione acuta, mentre provocano la necrosi in dosi elevate.

 

La messa a punto di test di tossicità cellulare (citotossicità): una costante in tossicologia

Il test messo a punto da Novaleads utilizza i meccanismi descritti finora. Esso utilizza cellule HeLa derivate da un cancro umano. Il vantaggio di queste cellule è che possono essere coltivate indefinitamente in terreni di coltura, lo svantaggio è che si tratta di cellule trasformate e dunque anormali, che non presentano necessariamente lo stesso tipo di sensibilità delle cellule normali alle sostanze tossiche.

Ricordiamo che in un organismo intero vi sono circa 200 tipi diversi di cellule (epatociti, fibroblasti ecc …) e che esistono due tipi di colture cellulari: quelle in sospensione e quelle in monosrato. Le cellule in sospensione possono essere contate con apparecchi come i citometri a flusso, la nuova tecnica sviluppata consente di contare agevolmente anche le cellule in monostrato.

Il principio del metodo: la fluorescenza

Il metodo è il seguente: quando si irradia una sostanza fluorescente con una radiazione (stimolante) di un certo colore, la sostanza emette una radiazione di colore differente di maggiore lunghezza d’onda. Irradiata con il colore blu, ad esempio, la sostanza emette un colore rosso. Le radiazioni sono misurate da spettrofluorimetri.

Il sistema elaborato da Novaleads consiste nell’aggiungere all’ambiente della coltura cellulare due biosensori fluorescenti che penetrano nelle cellule. L’uno si fissa al DNA e permette di misurare il numero delle cellule, l’altro si fissa alle membrane cellulari e permette di rilevare necrosi e apoptosi.

Il sistema è ingegnoso in quanto se i due sensori sono irradiati con una sorgente luminosa di lunghezza d’onda prestabilita emettono una fluorescenza di colore differente misurabile con uno spettrofluorimetro.

Perché sia possibile distinguere tra necrosi e apoptosi, inoltre, le cellule sono trattate con iodurio di propizio; la penetrazione di quest’ultimo nelle cellule è infatti caratteristica dello stato necrotico.

Gli autori del test hanno studiato i diversi parametri del metodo: selezione dei biosensori, loro concentrazione e tempi di marcatura, selezione dei filtri che consentono di misurare le differenti lunghezze d’onda, scelta delle cellule e supporti logici per l’analisi dei dati.

Essi hanno validato il loro protocollo con una molecola che induce l’apoptosi: la staurosporina.

Infine hanno testato su nove molecole diversi trattamenti o additivi alimentari e hanno ottenuto risultati coincidenti con quelli ricavati dagli studi precedentemente effettuati.

Si tratta dunque di un test affidabile, relativamente facile da mettere in opera ed economico che sarà certamente utile a tutti i tossicologi.

 

 

 
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